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[분석화학] UV-vis Spectroscopy Introduction -UV 정성/정량분석의 소개-

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UV-vis spectrophotometer : 네이버 블로그

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uv vis 그래프 해석

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Summary of article content: Articles about 고등학생을 위한 분광광도법 : (2) 정성분석 그렇다면, 자외선-가시광선(UV-Visible) 분광광도계를 사용해서 ‘무언가’ … 친절하게도 분광광도계는 투광도를 흡광도 그래프로 변환하여 보여준다. …
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고등학생을 위한 분광광도법 (2) 정성분석

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Most searched keywords: Whether you are looking for UV/VIS/NIR Spectrophotometer 자외선/가시선 분광광도계란? 장비의 스펙에 따라 UV/VIS 혹은 UV/VIS/NIR로 나뉘기도 한다. … 이때 흡수한 파장과 빛의 세기에 따라 그래프가 그려지는 것이다. 이름도 어려운 UV머시깽이. 분광광도계 이 장비는 특정 파장 영역에 따른 광원을 시료에 주사하려 흡광도나 투과율, 반사율을 측정하는 장비이다. *광원, detector, 적분구로 크게 나눌 수 있다. 장비의 스..
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UV-vis spectrophotometer

UV/ vis spectrophoto meter

UV-Vis Spectrophotometer (자외선-가시선 분광광도계)란?

어떤 시료 분자가 어느 파장의 빛을 흡수하며, 그 흡광도는 얼마나 되는지 측정하는 기기 장치

1. UV/ vis spectrophotometer 원리

1.1 원리

UV 분광기는 Ultraviolet(자외선)을 사용하며, 이 영역의 빛을 사용하면 분자의 결합전자가 들뜨게 되면서 빛의 흡수가 일어나고 이것을 측정한다.

분자의 구조를 밝히는 데에는 결정적이지 못하며, 주로 파이 전자계(double bond나 aromatic등)를 확인하는데 사용된다. 단일결합의 경우 결합전자가 들뜨는 데 필요한 에너지가 매우 크므로 (즉 파장은 짧아지므로 UV를 넘어감) 이 영역에서는 사용할 수 없다.

또한 UV는 가시광선 영역과 같이 분석물의 농도 측정에도 유용하게 쓰인다. Beer 의 법칙에 따라 흡광도(빛의 흡수되는 정도)는 물질의 농도에 비례하므로 빛을 얼마나 흡수했느냐에 따라 그 물질의 농도를 계산할 수 있게 된다.

UV/VIS 분광광도계는 많은 유/무기 화합물의 정량, 임상실험 등에 널리 쓰이는 분석기기이며, 화합물의 구조를 밝히는데도 어느 정도의 정보(정성적 정보)를 제공하지만, 구조의 파악보다는 정량분석에 더 중점을 두어 사용되고 있다.

UV/VIS 는 AAS 같은 기기와는 달리 원자에 대한 측정이 아닌 “분자”에 대한 측정이 가능하다. 분자내의 파이결합이나 n 전자가 있는 경우 UV/VIS 영역의 빛을 흡수하여 최외각 전자의 들뜸 현상이 일어나기 때문이다.

1.1.1 복사선의 흡수

흡수 : 자외선, 가시광선과 같은 복사선이 투명한 물질 층을 통과하는 경우 특정 주파수의 복사선 세기가 선택적으로 감소되는 것

들뜬 상태 : 복사선 에너지의 일부는 물질의 원자 또는 분자로 이동되어 입자가 바닥 에너지 상태에서 높은 에너지 상태로 되는 것

M + hi → M-e

M-e = 광자에너지 hi를 흡수하여 생성된 들뜬 상태의 원자 또는 분자의 입자

들뜬 상태의 수명은 대단히 짧으므로 곧 몇 단계의 이완과정을 거쳐 에너지를 잃어버리는데 가장 일반적인 이완과정은 다음과 같이 들뜬 에너지가 열로 변화되는 경우이다.

M* → M +열

M*의 수명은 대단히 짧기 때문에 어떤 순간에도 그 농도는 무시할 정도이며 생성된 열에너지는 일반적으로 검출할 수 없을 정도로 작다. 이완과정에서 M*가 분해되어 새로운 화학종을 생성하는 수도 있고 형광 또는 인광의 방출과정을 거치는 수도 있다.

1.1.2 전자 전이의 종류

가시-자외선 영역의 전자전이 : 분자의 최외각 전자 즉 원자가 전자가 관련

① σ, η, π – 전자전이

유기화합물의 원자 내 전자는 결합에 참여하는 형태에 따라 σ-전자, π-전자로 구별되며, 이러한 전자 전이는 전자가 결합성 궤도함수에서 반 결합성 궤도함수로 이동하는 것을 의미한다. 이때 전자의 전이는 선택규칙에 의해 제한된 에너지 준위에서만 가능하게 된다. 허용된 전이는 σ→σ* 전이, η→η*전이, π→η*전이가 있다.

② d, f – 전자전이

전이 금속은 d-전자를 포함하는 주 전이원소와 f-전자를 포함하는 란탄족원소 및 악티늄족 원소로 구분된다.

③ 전하이동 전이

전하이동 전이는 한 분자 내에 강한 전자 주개와 전자 받개의 성질을 띤 성분이 공존할 때 나타나며 몰 흡수율이 가장 크므로 분석에도 용이하고 정량 시에도 정확한 결과를 얻을 수 있다.

1.2 흡광도 측정원리

1.2.1 정의

-일정한 세기의 어떤 파장의 빛이 용액 층 통과 후, 광도가 일정세기로 될 때의 양

-세기 lo을 가진 어떤 빛이 용액 층 통과한 후에 광도가 l가 되면, 그 양은 log10(l0/l)으로 정의된다.

람베르트-베르의 법칙이 성립하는 경우,

= acd (ε= 몰흡광계수, c= 용액의 몰농도, d= 액층의 두께)

따라서 ε과 d를 알면 광학밀도 측정으로 농도 c를 결정할 수 있다.

그러나 광학밀도, 흡광도 등의 정의는 상당히 애매하며, log10(l0/l)을 흡광도라 하고 흡광도를 d로 나눈 값을 광학밀도라고 하는 경우도 있다. 이 경우 O.D.는 람베르트베르의 법칙이 성립하는 한 εc와 같고, 따라서 용질의 농도에 비례한다. 그러므로 어떤 표준상황에서 O.D.를 알면 그 물질의 용액의 O.D.를 측정함으로써 농도를 구할 수 있다.

1.2.2 흡광도의 이론

Figure 3과 같이 두께가 l인 용기에 농도 c인 용액을 채운 후 빛 Po를 투과시키면 빛은 용액에 흡수되므로 P만큼만이 통과되어 나오게 된다.

빛의 투광도(Transmittance) T는, T =

흡광도(Absorbance) A, A = -log10T =

-흡광도는 빛이 용액을 통과하는 두께와 흡광화학종의 농도에 정비례

A =abc(beer 법칙)

a : 흡광계수(absorptivity)

b : 용기의 두께, cm

c : 용액의 농도, mole/l

-보통 용기의 크기는 고정→ 표준용액의 농도를 다양하게(3개 이상) 변화시켜 흡광도를 측정→ 농도와 흡광도와의 관계 그래프를 작성, 미지시료에 대한 농도 구함

※주의 : Beer법칙은 측정농도 범위에서만 성립하므로 Standard Curve 작성 및 시료 농도 선정에 신중을 가해야 한다. (보통 0.01M ~ 10-6M 범위가 적당.)

기기에 의한 편차를 줄이기 위해서는 빛을 완전 차단했을 때 검출된 빛의 양을 0로, 용매만 담긴 용기를 장착한 후 빛을 통과시켰을 때 100이 되게 조정한다.

1.2.3 Lambert법칙

액체상태의 시료를 투명한 용기에 담아 빛을 투과시켜 변화된 빛에너지를 측정한다. 빛의 세기가 I인 빛이 두께가 b인 물질 층을 통과할 때 빛의 흡수로 인한 빛의 감소는 다음과 같이 수식으로 나타낼 수 있다.

dl = -kldb

여기에서, k는 비례상수, -부호는 세기의 감소를 의미한다. 이 식은 다시 다음과

같이 쓸 수 있다.

dl/l = -kdb

즉, “흡수된 빛의 분율은 통과되는 물질 층의 두께(b)에 비례한다.”는 뜻이다. b가 0일 때 입사광의 세기를 I0 이라고 하고 윗 식을 적분하면 다음과 같다.

=

1.2.4 Beer법칙

Beer의 법칙은 물질의 농도와 흡수되는 빛과의 관계 법칙인데, “흡수된 빛의 분율은 물질의 농도에 비례한다.”는 것이다. 같은 부피 내에서 시료 용질의 농도를 증가시키는 것은 물질의 두께를 증가시키는 것과 같은 효과가 있다. 따라서 위 식의 k는 농도 C에 비례하게 되므로, 다음과 같은 식을 얻을 수 있다.

=aC ( a = 새로운 비례 상수)

위의 두 식으로부터 Lambert – Beer 법칙의 관계식을 얻을 수 있는데,

= abC

여기에서 lt/l0를 투광도(transmittance, T)라고 하면,

= abC (보통 투광도는 %T로 나타냄.)

한편, log 1/T을 흡광도(absorbance, A)라 한다.

따라서, 정량 분석에서 실제 응용하는 Lambert-Beer의 법칙 관계식,

A = abC 또는 A = ξbC

(b=실제 흡수 용기두께(cm), a=농도가 g/l일때 상수(흡수 계수), ξ= 농도가 mol/L일 때 상수(몰흡수 계수)

1.2.5 검량선(Standard Curve, Calibration Curve)

Lambert-Beer의 법칙의 관계식은 어디까지나 이상적인 모델로부터 유도한 식이므로, 실제 시료에 대하여 이 법칙이 어느 정도 잘 맞는가를 검정해야 한다.

따라서 시료의 분석 파장을 결정한 후 그 파장을 고정시키고, 일정한 두께의 흡수 용기를 사용하여 알고 있는 몇 가지 농도에 대해 흡광도를 측정하여 검량선을 만든 후 Lambert-Beer의 법칙에 얼마나 잘 맞는가를 검정한다.

2. UV/Vis spectrometer 구성

UV-Vis Spectroscope의 실제 형태는 매우 다양하지만 기본적인 구성요소는 비슷하다. 최근 많이 이용되는 Double-Beam UV-Vis Spectrophotometer의 구조,

Figure 5.

Single-Beam UV-Vis Spectrophotometer에서 각각의 파장에서 시료와 용매의 흡광도는 수동으로 측정해야 한다. 그러나 위 그림의 double-beam design은 시료와 용매의 흡광도를 동시에 측정함으로써 편의성을 개선하였다.

광원의 빛은 자외선-가시광의 모든 파장 성분을 포함하는 백색광이며, 회절 격자 혹은 프리즘으로 이루어진 단색광 장치에 의해 백색광을 파장별로 분류하여 Reference와 Sample을 통과한 후 검출기에서 검출된다.

2.1 광원(Light source)

-광원이란, 빛을 생성하여 흡광도를 측정하는 전 파장영역에 일정한 세기를 유지, 충분한 복사선 에너지를 공급

-UV-Vis 영역을 측정하는 데 사용되는 대부분의 분광광도계에는 텅스텐과 중수소 램프(D2, Detrium)가 모두 사용. 이런 기기에서는 램프를 바꾸기 위해 광원 선택 기를 사용, 하나의 넓은 범위의 광원이 되도록 두 광원의 빛을 동시에 사용.

2.1.1 텅스텐램프

필라멘트를 텅스텐으로 만든 진공 백열전구로 325~1100nm의 가시광선영역에서 재현성 있는 일정한 빛의 세기가 나오며 보통 10,000시간 동안 사용이 가능하다.

Figure 6.

2.1.2 중수소램프

Figure 7.

190~325nm의 자외선 영역을 측정할 수 있으며 Deuterium lamp가 내는 빛의 세기는 lamp 사용 시 여러 요인에 의해 감소된다. 보통 1000시간 사용 후에는 빛의 세기가 크게 감소하게 된다. Lamp의 교체 시기는 원하는 분석감도, 파장범위, 램프 자체 성능에 따라 결정하며 lamp에서 자외선이 방출되므로 눈에 직접적인 노출을 피하여야 한다.

2.2 단색화 장치 (Monochromator)

회절격자(1mm 당 1000개 이상의 홈이 패어있음) 및 입사슬릿, 방출슬릿으로 구성되며, 회절격자를 회전시킴으로써 임의의 단색광을 입사슬릿으로 부터 나오게 하며, 이 빛은 다시 회절격자를 통해 분산되어 방출슬릿으로 전달된다. 다시 말해, 광원으로 부터 들어온 연속파장의 자외선 및 가시선을 각 파장별로 분산시켜 단색파장으로 만드는 장치이다. 슬릿의 폭이 좁을수록 파장 범위가 좁은 광이 얻어지므로 해상 능력은 좋아지나 광원의 에너지 값이 감소하여 검출능이 낮아질 수 있다.

Figure 8.

2.3 시료장착부

Figure 9.

시료 장착부(sample compartment)는 시료를 빛의 통로에 올려놓는 부위로서 시료가 특성에 따라 적절한 시료 용기(cell) 또는 악세사리가 사용된다. 이 때 시료 용액을 담는 용기는 측정하고자 하는 파장의 빛을 흡수하지 않아야 한다. 자외선-가시광에 대하여 투명한 석영으로 만든 관(cuvette)이 가장 널리 사용되는데, 빛의 통과 거리가 0.1 cm, 0.5 cm, 1.0 cm 등이 되도록 제작되어 있다. 경우에 따라 온도 조절기나 자동 시료 교환 장치 등을 시료장착부에 설치하기도 한다.

2.4 검출기

Figure 10.

빛이 시료를 통과하기 전과 후의 빛의 강도를 측정함으로써 시료가 흡수한 빛의 양을 측정하는 부위가 검출기(detecter)이다. 자외선/가시광선 범위의 빛을 검출하는 검출기에는 보통 3가지 종류가 있으며 이들은 각각 감도, 응답시간, 사용되는 파장범위 및 출력의 형태 등에 따라 차이점을 갖고 있다. 대부분의 기기에서는 광전증배관(photo multiplier tube) 또는 광전관(phototube)이 사용되고 있으며, 광전자발생관(photoemissive tube) 및 PbS cell과 같은 광전장치(photoconductive device), 자외선/가시부 전체 스펙트럼 영역을 매우 짧은 시간(수 ms)에 얻을 수 있는 광다이오드 어레이(photodiode array)나 CCD(Charge Coupled Device) 등도 개발되어 사용되고 있다.

2.5 광학부

광학부(optical components)는 광원으로부터 나온 빛이 단색광기와 시료를 거쳐 최종 검출기까지 이를 수 있도록 유도하는 부위이다. 여기에는 렌즈, 거울, 광분배기(beam splitter), 초퍼(chopper), 슬릿(slit), 창(windows) 등의 광학 장치들이 사용되는데, 빛이 광원으로부터 단색광기, 시료를 거쳐 검출기로 가능한 많은 양이 공간적으로 작은 부위에 집중적으로 전달될 수 있도록 한다.

2.6 전자, 전기 및 기계 장치

분광광도계에는 광원, 검출기 및 분광광도계 여러 부위에서 필요한 안정된 전원을 공급하는 장치, 단생광기 구동 장치, 슬릿의 폭 조절 장치, 시료부 제어 장치 등 여러 전기적 기계적 장치가 필요하다.

2.7 결과 표시부

얻어진 결과를 적절한 형태로 표시할 수 있는 장치 및 부가적인 연산을 위한 컴퓨터 자료 처리 시스템, 프린터도 분광광도계의 중요한 구성 요소가 된다.

3. 시료

3.1 시험 조작

Figure 11.

분광광도계를 사용하여 시료의 흡광도를 측정할 때에는 대조액(blank test)을 조제하여야 한다. 대조액은 흡광물질이 없는 용액을 말하는데 흡광물질을 제외하고는 시료용액과 반드시 동일하게 만들어져야 한다. 왜냐하면 시료 중에는 흡광물질 이외에 빛의 흡수에 영향을 미치는 다른 물질이 들어 있을 수도 있기 때문이다. 분광광도계는 반드시 빛의 통과율(%T)을 보정한 후에 사용하여야 한다.

즉 대조액에는 흡광물질이 들어 있지 않으므로 광원으로부터 나오는 빛을 100% 통과시킬 것이기 때문에 대조액의 통과율이 100%T를 나타내도록 보정하여야 하며 또한 광원으로 부터의 빛이 모두 흡수되어 검출기에 전혀 닿지 않는다면 통과율은 0%T를 나타내도록 보정하여야 한다.

일반적으로 분광광도계의 외부에는 세 개의 조절자가 있는데 두 개는 분광광도계의 보정을 위한 조절자(0%T와 100%T)이며 나머지 한 개는 파장 조절을 위한 조절자이다.

3.2 발색시약과 가리움제

흡광광도법은 이용하여 물질의 농도를 측정하고자 할 때, 일부 유기화합물이나 금속착물과 같이 자외선 및 가시광선 영역에서 빛을 흡수하는 성분의 경우에는 직접 분석하는 경우도 있으나, 자외선 및 가시광선 영역에서 빛을 거의 흡수하지 않는 성분을 분석할 때는 적당한 발색시약을 사용하여 빛을 흡수하는 화합물로 변화시켜야 된다. 발색시약은,

① 발색된 색이 예민하고 안정할 것

② 방해 성분이 적고 목저성분에만 반응할 것

③ 발색된 화합물의 조성이 명확할 것

④ Beer’s law를 따를 것

등의 조건을 지녀야 한다.

일반적으로 분석시료에는 흡광분석을 방해하는 물질들이 함유되어 있는 경우가 많으므로 이 때에는 제 3의 물질로서 가리움체를 첨가하여 방해물질의 작용을 방지할 수 있는데 가리움제는 방해물질이 발색시약과 반응하지 못하게 하는 역할을 한다.

3.3 용매

Figure 12.

-시료용액 준비 시에 용매는 모든 종류의 화합물을 용해시킴. 비가연성, 독성이

없고 모든 파장에서 완전히 빛을 투과시켜야 함.

(농도, pH, 시료의 온도 또한 흡광도에 영향을 미치므로 주의)

-물, 알코올, 에스테르 및 케톤 등의 극성용매 : 진동효과로부터 오는 스펙트럼의 세밀한 구조를 지우려는 경향

-자외선 분광 광도법에서 흔히 사용되는 용매 : 물, 95%에탄올, 시클로헥산

-가시선영역 : 모든 무색 용매가 사용 가능

4. 데이터 해석 방법

4.1 UV-Vis 흡광도 측정 방법

1. Computer를 먼저 켠 후, UV-Vis Spectrophotometer를 켠다.

2. UV-Vis Spectrophotometer의 램프가 안정화 되었는지 확인한다.

그림 Figure 13.

3. [LapPro Plus]를 클릭하여 프로그램을 실행시킨다.(프로그램 실행 전에 샘플 고정 틀에 sample과 reference위치를 잡고, 영점을 잡음.)

4. 측정할 Parameters의 값을 원하는 조건으로 설정한다.

5. Reference(Solvent), Sample을 고정틀에 넣는다.

6. 측정을 하기 이전에 Reference를 먼저잡고, Sample을 측정한다.

4.1.1 UV-Vis 흡수

UV(ultra violet)는 보통 파장 200-400nm 인 자외선이고 VIS(visible)은 파장 400nm~800nm정도의 가시광선을 뜻한다. 이 범위의 광선에 의해 어떤 물질의 전자전이가 일어나면 그 파장의 빛을 흡수한다. 따라서 흡수하는 파장으로부터 물질에 대한 정성적인 정보와 그 흡수 정도에 따라 정량적인 정보를 알 수 있다.

빛을 많이 흡수하는 시료가 있으면 빛의 세기가 줄어들고, 시료가 많을수록 빛을 많이 흡수하나 투과도는 줄어드는 원리를 이용하여 물질의 정량분석을 하고 있다. 이를 농도와 비례하는 신호로 바꾸기 위해 A를 흡광도로 정의하여 사용한다. 흡광도는 농도에 비례하기 때문에 투과도를 사용하는 것보다 정량에 더 편리하다.

4.2 흡광도 측정에 의한 정량 분석

4.2.1 정량 분석에 유용한 이유

1. 응용 범위가 광범위하다

2. 감도가 높다.

3. 정확도가 높다.

4. 선택성이 좋다.

5. 측정 방법이 비교적 간편하다.

4.2.2 유기 화합물의 분석

1. 용매에 시료를 녹인 후 자외선 영역에서 max를 분석파장으로 하여 흡광도 측정

2. 디아조화(diazotization) 짝지음 반응(coupling reaction)을 이용

3. 금속이온과 착 화합물을 형성시켜 발색시킴.

4.2.3 금속, 비금속 및 음이온의 분석

금속이온 – 발색 시약을 가하여 색깔을 띠게 하고, 가시선의 max를 분석 파장으

로 선택

발색 시약 – 금속과 반응하여 유색의 착이온을 형성 시키는 킬레이트 시약

4.2.4 범위

① 흡광 화학종에의 응용

일반적인 여러 가지 유기 발색단 작용기가 수록

Figure 14.

Figure 15.

② 흡광하지 않는 화학종에 대한 응용

많은 착화제들이 무기화학종을 정량하는데 많이 이용되고 있다

대표적인 무기시약으로 철, 코발트, 몰리브덴에 대한 티오시안산, 티탄, 바나듐 및 크롬에 대한 과산화수소의 음이온, 비스무트 , 팔라듐, 및 텔루르에 대한 요오드화이온들이 사용된다.

양이온와 안정한 색깔을 띤 착물을 만드는 유기 착화제 : 철 정량에 사용되는

o-phenanthroline, 니켈에 대한 dimethylglyoxime, 구리에 대한

diethyldithiocarbamate, 납에 대한 diphenyldithiocarbazone등이 있다.

니켈의 광도법 정량에 대한 최종 반응의 응용에서 양이온은 수용액은 섞이지 않는 유기액체에 녹인 착화제 용액으로 추출된다. 얻어진 밝은 빨강색 층의 흡광도가 금속 농도의 척도가 된다.

4.2.5 방법

① 분석하고자 하는 물질의 흡수 스펙트럼을 측정하여 최대 흡수가 일어나는 파 장(λ) 과 몰 흡광 계수(ℇ) 를 결정.

② 검량 곡선을 작성

4.2.6 상세한 조작 과정

① 파장선택

최고의 감도를 얻기 위하여 분광광도법에 의한 흡광도 측정은 단위 농도 당 흡광도 변화가 최대가 되기 때문에 최대 흡수에 해당하는 파장에서 수행하는 것이 일반적이다.

이에 흡광도는 최대 흡수에서 파장에 대해 일정해서 Beer법칙에 잘 따른다.

② 흡광도에 영향을 주는 변수

어떤 물질의 흡수스펙트럼에 영향을 주는 일반적인 변수에는 용매성질, 용액의 pH, 온도, 전해질의 농도 및 방해물질의 존재 등이 있다.

③ 셀의 세척와 취급법

셀은 긁힘, 부식, 닳음, 등으로 생길 수 있는 차이를 검출하기 위하여 정기적으로 서로에 대해 검정하여야 한다. 그리고 셀을 씻고 말리는 적당한 방법을 사용하는 것도 마찬가지로 중요하다.

Erickson과 Surles는 셀의 바깥 창을 깨끗이 하는데 다음과 같은 방법을 사용하도록 추천

→ 측정하기 전에 셀 표면을 분광용 급 메탄올을 적신 렌즈종이로 깨끗이 한다. 이 종이는 메탄올이 날라 가지 않도록 잘 보관 한다. 그 후 셀을 방치 하면 메탄올은 증발하고 용기 표면은 깨끗하게 된다. 이 방법은 용기 표면에 마른 렌즈로 종이로 닦아서 실 보푸라기나 필름을 남기는 때보다 훨씬 좋다는 것을 보여주었다.

④ 흡광도와 농도 사이의 관계 측정

농도에 대한 흡광도의 관계를 확립하기 위하여 외부표준법이 가장 자주 이용.

분석실험 조건이 결정된 다음에는 시료의 예상되는 농도를 포함하는 일정 농도범위를 갖고 일련의 표준용액을 이용하여 검정곡선을 만든다.

Beer법칙에 따른다고 가정하고 몰 흡광계수를 측정하는데 한 개의 표준용액만을 사용하는 것은 위험한 일이다.

이상적으로 검정 표준물은 분석물의 농도뿐만 아니라 시료 매트릭스에 있는 다른 화학종의 농도도 분석하려는 시료의 조성과 거의 같아야 한다. 이것은 측정된 흡광도에서 다양한 성분의 효과를 최소화 시킬 수 있다. 원하는 반응이 가끔 불완전하여 낮은 흡광도를 얻기도 한다.

4.3 정성분석

․ 표준물질이 있는 경우

시료 물질과 같은 조건에서 스펙트럼을 측정하여 비교.

․ 표준 물질이 없는 경우

– 표준 스펙트럼 (Sadler Spectra , Electronic Spectral Data)

․ 용매의 선택이 중요

-종류에 따라 흡수 파장이 달라지므로

4.4 측정값이 달라졌을 때

같은 시료를 같은 방법대로 측정했는데 과거와 측정값이 다르게 나온다면 아래의 두 가지 사항을 점검해 보아야 한다.

– Different bandwidth

– Differing stray light characteristics

․ Bandwidth

Figure 16.

분광광도계의 해상 능력으로 좁을수록 좋은 해상도를 보이며 absorbance value에도 영향을 미친다.

․ Stray light

분광광도계 단색화 장치(monochromator)에서 stray light이 발생되며, 주로 optical surface의 오염이 원인이 되어 빛이 단색화 장치를 통해 분산될 때 선택된 파장 이외에 다른 파장들에 의해서 발생된 빛이다.

Figure 17.

5. 실험응용분야

5.1 보석감별

자외선·가시광선·근적외선 분광광도계는 빛의 파장 또는 진동수에 따른 특정한 파장의 빛을 흡수하여 일으키는 흡광도를 측정한다. 보석의 흡광도를 측정하기 위해서는 일정한 세기의 빛을 보석에 통과시킨 후 통과전후의 빛의 세기를 비교하여 측정하기 때문에 보석의 투명도와 커팅 형태에 의해 있을 수 있는 오차를 최소한으로 줄여야한다. 따라서 오차를 최소한으로 줄이기 위하여 보석을 측정할 수 있는 특수 액세서리를 반드시 제작하여야 한다.

보석의 원자나 분자는 종류에 따라 다른 특정한 파장의 빛을 흡수하기 때문에 흡수되는 파장을 알게 되면 원자나 분자의 종류를 알 수 있다. 현재 본 감정원의 보석분석연구실에서는 자외선·가시광선·근적외선 분광광도계를 사용하여 HPHT 처리된 팬시다이아몬드의 감별, 인공적으로 방사선 조사된 다이아몬드의 감별, 착색 처리된 골든 컬러 및 흑진주 등의 감별, 블루 사파이어의 산지 구분 및 무색 사파이어의 천연, 합성의 기원뿐만 아니라 에메랄드의 산지 구분, 루비의 산지 구분, 페리도트의 천연 및 합성의 기원, 알렉산드라이트의 천연 및 합성의 기원 등을 감별하는 데에 이용이 되고 있다.

5.2 광도법 적정

Figure 18. 광도 적정 곡선

1) 직접 광도법 적정

반응물, 생성물의 농도 변화에 의해 나타나는 흡광도 변화로 종말점을 알아냄

2) 간접 광도법 적정

첨가한 지시약의 흡광도가 적정 용액의 부피 함수로 나타남

3) 장 점

다른 방법으로 종말점을 얻는 것보다 훨씬 정확

5.3 혼합물의 분석

Figure 19. 순수한 물질 X,Y 및 X와 Y에 대한 흡수 스펙트럼

시료에 2가지 이상의 성분이 혼합 – 흡광도는 가감성을 나타냄

성분 A, B

파장 1 에서 측정 —– x1, y1

파장 2 에서 측정 —– x2 y2

A1 = Ax1+ Ay1 = x1bCx + y1bCy

A2 = Ax2+ Ay2 = x2bCx + y2bCy

Cx, Cy

5.4 착 화합물에 있어서 금속-리간드의 몰비 결정

nM + pL → MnLp

p/n을 결정하는 방법

1) 몰비법(mole ration method, Job법)

한 가지 성분의 농도를 고정하고 나머지 성분의 농도비를 바꾸어서 착화합물의 최

대 흡수 파장에서 흡광도를 측정한다.

2) 연속 변화법

금속이온과 리간드의 전체 농도를 고정하고 이들의 몰분율을 변화시켜 가며 흡광도

를 측정하는 방법이다.

3) 단점: 착물을 포함하는 용액이 Lambert-Beer의 법칙을 벗어나는 경우 해리상수

가 큰 방향으로 오차를 유발한다. 착물이 공존하거나 부산물이 생성될 경우 신빙성

이 없다.

Figure 20. 몰 비법과 연속 변화법

5.5 평형 상수 및 이온화 상수의 결정

착화합물의 농도와 흡광도와의 관계로부터 평형상수 계산한다.

용액의 pH에 따라 최대 흡수점 및 흡광도가 다르게 되므로 해리상수 결정한다.

5.6 정제 및 미량 분석

유기물을 정제할 때 미량의 불순물이 강한 흡수를 일으킬 경우스펙트럼을 이용하여

불순물의 종류 및 양을 결정한다.

불안정한 생화학 물질 → 흡수 스펙트럼 자료로 물질의 순도를 확인

고등학생을 위한 분광광도법 : (2) 정성분석

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고등학생을 위한 분광광도법 : (2) 정성분석

– 흡광 스펙트럼의 최대 흡수 파장 –

0. 들어가기

우리는 앞선 글(1)을 통해 장치(분광광도계)가 시료를 분석하는 과정에 대해 간단히 알아보았다. 간략히 정리하면 다음과 같다.

일정한 세기의 빛(P 0 )이 장치의 램프 광원으로부터 출발한다. 빛이 지나가는 경로에 시료가 놓이면, 시료는 빛을 흡수한다. 시료를 통과한 나머지 빛(P)이 검출기에 도달한다.

장치는 검출기에 도달한 빛의 세기(P 0 )와 처음 쬐어 준 빛의 세기(P)의 분율인 투과도(T)를 알려준다. 물론, 대부분 장치들이 투과도를 흡광도로 변환하여 알려줄 수 있다. 그런데, 이 흡광도(A) 값이 농도와 완전히 선형적으로 비례하기 때문에 유용하게 사용될 수 있다.

그렇다면 우리는 언제 분광광도계를 사용하면 좋을까? 분광광도계를 활용하면, 고등학교 수준에서의 자유탐구나 과제연구 퀄리티를 향상시킬 수 있다고 말했다. 막상 좋은 결과를 위하여 분광광도계를 사용하겠다는 마음을 먹지만, 어떤 경우에 필요한 것인지 모른다면 그 시도가 무의미하다.

1. ‘무언가’를 확인한다는 것

우리가 새로운 무언가를 합성(synthesis)하든, 시료로부터 무언가를 추출(extraction)하든 최종적으로 얻은 결과물의 겉모습만 보고, “와우! 성공적인 실험이었어!” 라고 절대 말할 수 없다.

물론, 확연한 색 변화를 갖거나 겉보기 성질이 완전히 달라지면 어느정도 추측하여 기대 정도는 할 수 있다. 하지만 뚜렷한 근거없이 ‘이건 내가 원한 그게 맞아!’ 라고 믿어버리는 것은 굉장히 위험한 일이다. 물질 합성 실험으로 대표되는 ‘아스피린(aspirin)의 합성 과정’을 예로 들어보자.

우리는 실험책 또는 실험 전 직접 작성한 예비 보고서 순서에 따라 ‘살리실산’과 ‘아세트산 무수물’을 산 촉매 하에서 반응시킨다. 가열, 건조 등 여차 저차의 과정을 거치다보면, 허연 ‘무언가’를 얻는다. 아직까지 무엇인지 알 수 없지만, 보통은 ‘이게 우리가 원한 아스피린이지 않을까?’라는 기대를 한다.

그림 1. 아스피린으로 추정되는 물질 (영상캡쳐) [출처 및 원본 영상 주소] 유투브-한국화학연구원 KRICT https://youtu.be/_wmBuroKhvc

그런데, 책에 정제가 필요하다고 쓰여있다. 비록 원리를 모를지라도 책에 쓰인 방법을 참고해 몇 단계를 더 거친다. 정제 전과 비슷하면서도 다른 ‘무언가2’가 얻어졌다. ‘무언가2’ 역시 ‘아스피린’으로 추정되지만, ‘무언가1’보다 더 순수할 것이라는 기대감이 더해졌다. 우리는 무엇을 만들었을까?

실험 방법에 오류가 없고 숙련된 실험자가 수행했다면, 주된 생성물(major product)인 아스피린을 얻었을 확률이 높다. 하지만, 아무리 숙련된 실험자라 할 지라도 분석(확인) 과정을 거치기 전까지는 그저 ‘무언가’일 뿐이다.

결국, 이러한 모호함을 해결해주는 것이 분석이다. 정성분석(qualitative analysis)은 실험자가 얻은 ‘무언가’의 ‘특성’을 확인하여 그 정체를 구체화하는 것을 말한다. 반면, 정량분석(quantitave analysis)은 얻어진 ‘무언가’의 ‘양’을 구체화한다.

실험책에는 보통 아스피린 합성 후에, 녹는점을 측정하도록 되어 있다. 측정한 녹는점과 ‘아스피린’의 녹는점을 비교해서 합성 여부를 확인한다. 만약 측정한 값이 이미 알려진 아스피린의 것과 유사하다면, 아스피린( 이 많이 포함된 무언가 )을 합성했다고 말할 수 있는 근거가 될 수 있다. 당연한 말이겠지만 순수한 아스피린의 녹는점을 사전에 알아야 비교할 수 있겠다. (참고로 아스피린의 녹는점은 135 ℃, 살리실산의 녹는점은 158.6 ℃ 이다.)

2. 분광광도계로 ‘무언가’ 확인하기

그렇다면, 자외선-가시광선(UV-Visible) 분광광도계를 사용해서 ‘무언가’를 구체화할 수는 없을까? 분광광도계는 우리에게 물질이 좋아하는(흡수하는) 빛에 대해 알려준다. 다음 예를 살펴보자.

Q. 방 안에 막대사탕이 잔뜩 들어있는 통이 있다. 처음에는 통 안에 딸기 , 오렌지 , 레몬 , 사과 , 포도맛 사탕이 골고루 들어있었다. 그런데 A ~ D 중 ‘누군가’가 방에 들어갔다 나온 뒤, 통 안에는 레몬 , 사과 , 딸기맛 사탕만 남아있었다. A ~ D 중 누가 방에 들어간 것일까?

A : 레몬맛(노랑) 사탕을 좋아한다.

B : 포도맛(보라) 사탕과 오렌지맛(주황) 사탕을 좋아한다.

C : 사과맛(초록) 사탕을 좋아한다.

D : 딸기맛(빨강) 사탕을 좋아한다.

주어진 정보만을 이용한다면 B가 방에 출입했다고 추론 가능하다. 분광광도계를 통한 물질의 구체화 과정은 위의 사탕 예시와 비슷하다. 물질마다 좋아하는 파장의 빛(사탕의 종류)이 다르다고 생각하자.

분광광도계 램프 광원에서 다양한 파장의 빛(사탕 뭉치)을 쏴준다. 분석 물질은 좋아하는 파장 영역대의 빛(좋아하는 사탕)을 흡수하고, 나머지 빛(남은 사탕)은 그대로 통과시킨다. 나머지 빛(남은 사탕)만 검출기에 도달한다.

그림 2. 흡광도 측정 과정은 다양한 사탕이 들어있는 통에서 좋아하는 맛 사탕을 빼가는 것과 같다.

앞서 우리가 남은 사탕 종류만으로 B가 방에 출입했음을 추론했듯이, 검출기에 도달한 나머지 빛을 통해 분석물이 좋아하는 빛의 파장 영역대를 추론할 수 있다. 친절하게도 분광광도계는 투광도를 흡광도 그래프로 변환하여 보여준다.

우리가 합성한 ‘무언가’가 아스피린임을 확인하고 싶다면, 아스피린이 어떤 빛(어떤 색깔 사탕)을 좋아하는지 사전에 알고 있어야 한다. 아스피린의 녹는점을 사전에 알고 있어야 우리가 측정한 값과 비교할 수 있고, A ~ D 중에 누가 어떤 사탕을 좋아하는지를 알아야 방에 출입한 사람을 추론할 수 있는 것과 같은 이치다.

우리는 비교를 위한 아스피린의 UV-Vis 스펙트럼이 필요하다.

그림 3. 아스피린(aspirin)의 흡광 스펙트럼 이미지 검색 결과

아스피린은 흰색 고체이다. 겉보기에 색이 없는 물질은 대체로 가시광선(visible light) 영역에서 빛을 흡수 하지 않는 경우가 많다. 구글에 ‘aspirin UV spectrum’ 으로 검색하자 수많은 이미지들이 나타난다. 대부분 비슷한 그래프 개형을 보여주고 있다. 우리의 조건과 최대한 비슷하고, 믿을만한 그래프를 찾는 것이 중요하다.

만약, 실험실에 샘플이 될만한 정제된 아스피린이 있다면, 검색할 필요 없이 직접 두 시료의 흡광도를 측정하여 비교해보는 것도 하나의 방법이다.

3. 흡수 스펙트럼(흡광 스펙트럼) 이해하기

물질의 흡수 스펙트럼을 검색하거나 측정해보면, 파장에 따른 흡광도 그래프로 결과가 표현된다. 그래프의 x 축은 장치가 측정한 빛의 파장 영역을, y 축은 물질의 흡광도이다. (단, 적외선(IR) 스펙트럼의 경우에는 투광도로 표현하는 것이 일반적이다.)

당연히 그래프의 흡광도 값(y)이 커질수록 해당 파장의 빛을 많이 흡수한다는 뜻이다. 아래의 <그림 4>는 식용 색소 성분 물질 두 가지의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 겉보기 색을 갖는 물질들은 일반적으로 가시광선 영역에서 흡수띠를 갖는다.

그림 4. 식용색소 에리트로신(좌, RED)과 브릴리언트 블루 FCF(우, BLUE)의 흡수 스펙트럼 [그림 출처] https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_with_a_Biological_Emphasis_(Soderberg)/Chapter_04%3A_Structure_Determination_I/4.4%3A_Ultraviolet_and_visible_spectroscopy

첫 번째는 식용색소 적색 3호의 성분 물질인 에리트로신(erythrosine)의 스펙트럼이다. 스펙트럼은 약 480 ~ 560 nm 부근에서 강한 흡수를 보이며, 특히 524 nm부근에서 최대 흡수(봉우리)를 갖는다. 480 ~ 560 nm 부근은 가시광선 영역의 녹색에 해당한다. 적색 3호는 대체로 녹색 영역의 빛을 흡수한다.

두 번째 그래프는 식용색소 청색 1호의 성분 물질인 브릴리언트 블루 FCF(brilliant blue FCF)의 스펙트럼이다. 스펙트럼은 560 ~ 680 nm 부근에서 넓고, 강한 흡수를 보이며, 특히 630 nm 부근에서 최대 흡수(봉우리)를 갖는다. 560 ~ 680 nm 부근은 가시광선 영역의 노랑 ~ 빨강 영역에 해당한다. 청색 1호는 노랑 ~ 빨강 영역의 빛을 흡수한다.

그림 5. 파장에 따른 색깔과 보색 관계

그래프를 통해 우리가 겉으로 보는 물질의 색이 흡수하는 빛의 보색(<그림 5>의 색 동그라미 반대편에 위치하는 색)이라는 것을 알 수 있다.

아래의 <그림 6>는 식물에 함유된 엽록소(chlorophyll)의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 엽록소 a와 b에 따라 약간의 차이는 있지만, 400 ~ 500 nm 부근의 청자색과 620 ~ 700 nm 부근의 황적색을 잘 흡수하는 것을 알 수 있다. 이 때문에 우리는 엽록소가 녹색으로 보인다.

그림 6. 엽록소의 흡수스펙트럼 [출처] https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chlorophyll_ab_spectra-en.svg

4. 정리하면

분광광도계는 우리에게 물질이 흡수하는 빛에 대한 정보를 준다. 색을 갖지 않는 물질은 보통 가시광선 영역에서 흡광도를 갖지 않는다. 이런 경우 자외선 영역이나 적외선 영역에서 빛을 흡수할 수 있다.

반면, 색을 갖는 물질은 대체로 가시광선 영역의 빛을 흡수한다. 물질의 겉보기 색은 흡수하는 빛의 파장 영역에 해당하는 색상과 보색 관계에 놓여 있다. 따라서 최대흡수파장(λ max )을 알면 대략적인 겉보기 색을 예상할 수 있다.

분광광도계는 분석 물질이 무엇인지 확인하는 방법 중 한 가지로 사용될 수 있다. 그것도 모든 상황에서 가능한 것은 아니다. 비교할 수 있는 표준 시료가 있거나 신뢰도를 갖춘 파장-흡광도 그래프가 있는 경우에만 어느정도 가능하다.

흡광도 측정만으로는 물질 확인의 강력한 근거가 되기는 어렵기 때문에 다른 물리적 특성을 함께 확인하거나 몇 가지 분광학적 방법을 함께 확인하는 방식으로 보완하는 것이 좋다. 내가 레몬맛 사탕을 제일 좋아하는데, 와이프도 레몬맛을 제일 좋아한다. 사탕 뭉치만을 통과시켜서는 와이프와 나를 구별할 수 없다. (물질을 구체화(확인)하는 가장 일반적인 방법은 NMR과 MASS의 조합이다.)

분광광도법이 물질을 확인하는 과정에 단독으로 사용되기에는 분명한 제한점이 있지만, <그림 7>과 같이 겉보기에 색 차이를 보이는 물질들 간의 비교에는 흡광도 측정이 효과적이다. 겉으로 보기에는 “어? 물질들 간에 색깔이 달라보이는데?” 정도에 머무르겠지만, 흡수 스펙트럼을 측정해보면, 파장에 따른 흡광도 차이가 분명히 수치적으로 비교되기 때문이다.

그림 7. Alq3와 유도체(2-methyl, 5,7-dichloro, 5-chloro, 5,7-dimethyl) – [UV325nm, CH2Cl2 용액]
만약, 학교에 분광광도계가 있고, 장치 사용법을 먼저 익히고 싶다면, 시중에 나와있는 식용 색소를 이용하여 연습하도록 하자. 색상이 비교적 다양하여 색소별 그래프 비교가 쉽고, 실습 후 뒷처리도 수월하기 때문이다. 뒤 이어 소개할 정량분석 또한 식용 색소를 이용해서 비교적 간단히 연습할 수 있다.

연습을 통해 장치 사용법을 익혔다면, 자신들의 과제 연구에 적용할 수 있을지에 대해 고민해보자.

끝까지 읽어주셔서 감사합니다.

(2) 정성분석편 – 끝 –

다음글 :

3) 정량 분석 – 검량선의 작성과 미지 용액의 농도 결정

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1) 기초 – 분광광도계의 분석 원리와 Beer-Lambert 법칙

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이름도 어려운 UV머시깽이. 분광광도계

이 장비는 특정 파장 영역에 따른 광원을 시료에 주사하려 흡광도나 투과율, 반사율을 측정하는 장비이다.

*광원, detector, 적분구로 크게 나눌 수 있다.

장비의 스펙에 따라 UV/VIS 혹은 UV/VIS/NIR로 나뉘기도 한다.

*UV(자외선), VIS(가시광선), NIR(근적외선)

source : BENQ

장비 원리

– 외부에서 빛 에너지를 흡수

– 분자 운동이 발생(진동, 전이 등)

– 분자가 바닥 상태에 있을 때 특정 파장을 흡수하면서 들뜬 상태가 된다. *흡수 스펙트럼

– 이때 흡수한 파장과 빛의 세기에 따라 그래프가 그려지는 것이다. 이는 분자의 농도나 구조를 분석할 수 있는 지표가 된다. *혹은 원자

*장비에 따라 측정할 수 있는 시료의 상이 상이한데, 큰 장비인 경우 고체와 액체 시료 모두 측정이 가능한 경우가 많다.

장비를 통해 알 수 있는 것

– 흡광도, 투과율, 반사율

– 에너지 밴드갭, 농도와 흡광계수

*Tauc plot

Tauc plot이란 분광광도계 장비를 통해 측정한 흡광도를 이용해 에너지 밴드갭을 구하는 데 이용하는 방식이며, 순서는 아래와 같다.

1) 측정을 통해 시료의 흡광도를 측정한다.

2) 측정한 데이터를 기반으로 하단 이미지와 같이 Tauc plot의 x축인 E(에너지)를 계산한다.

3) y축이 되는 (ahv)^2은 하단과 같은 식을 이용해 구할 수 있다.

4) 이걸 파장별로 쭉 이으면 아래와 같은 그래프를 얻을 수 있으며, 그래프가 상승하는 구간(거의 직선에 가까운 구간)의 선을 직선으로 연장하여 x축과 만나는 지점이 에너지 밴드갭이 된다.

source : November 2016Beilstein Journal of Nanotechnology 7(1):1662-1673

참고할만한 포스팅은 하단 링크 참조

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